1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號(hào)：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒

3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號(hào)：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號(hào)：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號(hào) ：Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫(kù)

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時(shí)若GX檢測(cè)6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無(wú)上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫(kù)方法

3.1建庫(kù)流程

1) 全長(zhǎng)cDNA的合成

A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑

B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，置于PCR儀上

C.72℃ 3min，42℃ 2min，72℃到42℃降溫速率設(shè)置為 0.1℃/s

D.在上步反應(yīng)期間，配制如下Mix

E.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，42℃預(yù)熱1min后立即進(jìn)行下步反應(yīng)

F.取5.5μL預(yù)熱的Master Mix加入上步反應(yīng)完成的PCR管中；輕彈混勻，瞬時(shí)離心

G.42℃ 90min，70℃ 10min

H.向上述反應(yīng)完成的cDNA產(chǎn)物中加入70 μL Elution Buffer（試劑盒自帶，后邊簡(jiǎn)稱EB）進(jìn)行稀釋（總體積80μL）

2)PCR擴(kuò)增

A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑

B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，將Mix平均分到0.2mL PCR管中（每管50μL）

C.將PCR管置于PCR儀上，按照PCR條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增

3)PCR純化

A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中

B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.5X（25μL）體積的AMPure?XP磁珠，充分混勻，瞬時(shí)離心

C.置于四維旋轉(zhuǎn)儀上混勻結(jié)合15 min

D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加入1.5mL的新配置的80%乙醇，靜置30s

F.棄上清，重復(fù)漂洗一次

G.棄盡上清，室溫干燥30 s

H.向兩個(gè)1.5mL離心管分別加入22μL的Elution Buffer，輕彈混勻，置于四維旋轉(zhuǎn)儀上5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管

J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量

4)DNA修復(fù)

A. 向純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s

C.向每個(gè)樣品中加入14μL Reaction Mix 1

D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s

E.孵育

5)接頭連接

A.向上述產(chǎn)物中加入以下試劑

B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s

C.向每個(gè)樣品中加入35μL Reaction Mix 2

D.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻，瞬離1s

E.孵育

6)PB純化

A.向樣品中中加入1*體積的SMRT bell cleanup beads（室溫平衡30min）

B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s

C.室溫放置10min，瞬離1s

D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離，備用

E.使用1.5ml新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次

F.瞬離1s，將酒精棄凈

G.向管中加入40μL1XElutionBuffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻

H.室溫5min溶解DNA，瞬離1s

I.吸取40μL上清液于新的1.5mL低吸附離心管中

J.取1μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定

4、測(cè)序方法

1)使用Sequel II Binding kit 2.1（Pacbio，USA） 對(duì)上機(jī)文庫(kù)進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫(kù)結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）

2)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行AMPure PB（Pacbio，USA）純化后置于SequelII（Pacbio，USA）測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序

5、實(shí)驗(yàn)試劑

6、實(shí)驗(yàn)設(shè)備