1、提取方法

1.1植物組織：CTAB法

1)液氮研磨樣品，分裝至離心管中

2)向離心管中加入 CTAB，水浴

3)離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心

4)向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清

5)加入 75％乙醇，離心，棄上清

6)晾干，加入 TE 溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2動(dòng)物組織：SDS法

1)液氮研磨組織樣，分裝至離心管中

2)加入 SDS 溶液，水浴

3)加入 NaCl 溶液，靜置后離心

4)向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心

5)向上清中加入異丙醇后離心，棄上清

6)加入 75％乙醇，離心，棄上清

7)晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101

1.4粗體核酸純化

試劑盒名稱(chēng)：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223

試劑盒名稱(chēng)：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243

1.5微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

1)濃度檢測(cè)

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000

Qubit：invitrogen ，型號(hào)QubitTM3Flurometer

2)完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600

電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥2μg（單次建庫(kù)）

2)濃度≥50ng/ul

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280在1.7-2.2之間，OD260/230在1.7-2.5之間

5)AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無(wú)或有輕微污染，N/Q在0.9-2.0之間

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)

3、建庫(kù)方法

3.1建庫(kù)流程

1) 準(zhǔn)備高質(zhì)量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化

2)使用BluePippin進(jìn)行片段篩選

3)使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加 A

4)使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒添加 barcode 序列

5)使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒完成測(cè)序接頭的連接

3.2建庫(kù)試劑

1)文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext FFPE DNA Repair Mix 貨號(hào) M6630L 廠家 NEB

2)文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 貨號(hào)E7546L 廠家NEB

3)文庫(kù)構(gòu)建試劑：無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒1-96 貨號(hào)SQK-NBD114.96 廠家Nanopore

3.3建庫(kù)設(shè)備

數(shù)字 3*32PCR 儀 廠家 Appliedbiosystems 儀器規(guī)格 proflex3*32

制冷型程控五段金屬浴 廠家 天根生化科技（北京）有限公司 儀器規(guī)格 OSE-DB-02

4、測(cè)序方法

4.1上機(jī)操作

1)用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix

2)用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫(kù)

3)用 PromethION Flow Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開(kāi)始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)

4.2測(cè)序試劑

測(cè)序芯片制備試劑盒 貨號(hào) EXP-FLP004 廠家 Nanopore

測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒 貨號(hào) EXP-AUX003 廠家 Naonopore

測(cè)序芯片 PromethION Flow Cell(R10.4.1) 貨號(hào) FLO-PRO114M 廠家 Nanopore

4.3測(cè)序設(shè)備

PromethION48 測(cè)序儀 廠家 Nanopore 儀器規(guī)格 PromethION48