1、提取方法

1)植物葉片：（天根 DP441（廠家：天根，型號(hào)：DP441）

2)植物根、莖、種子：艾德萊 RN40（廠家：艾德萊，型號(hào)：RN40））試劑盒

3)動(dòng)物常規(guī)組織：TRIzol

4)皮膚、毛發(fā)：凱捷 217044（廠家：凱捷。型號(hào)：217004）

5)全血PAX管送樣：PAXgene Blood miRNA Kit(50)（廠家：GENENODE。型號(hào)：2145A）試劑盒

6)EDTA抗凝血：TRIzol

2、檢測(cè)方法

2.1檢測(cè)方法

使用 Nanodrop2000 （廠家：賽默飛，型號(hào) ：Nanodrop2000）對(duì)于提取的核酸進(jìn)行濃度純度檢測(cè)，并使用 LabChip GX（廠家：鉑金埃爾默，型號(hào)：LabChip GX Touch HT）對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)

2.2判定標(biāo)準(zhǔn)

1)總量≥1（ug），滿足 2 次建庫

2)濃度≥20（ng/ul）

3)體積≥10(ul)

4)OD260/280 在 1.7-2.5 之間，OD260/230 在 0.5-2.5 之間，260nm 吸收峰顯示正常

5)RIN值≥8（非植物），RIN值≥7.5（植物），同時(shí)若GX檢測(cè)6.0-6.4的需結(jié)合基線判斷，28S/18S≥1 且基線無上抬或輕微上抬

6)樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

3、建庫方法

3.1建庫流程

1) 全長cDNA的合成

A.取新的0.2mL PCR管，置于冰上，加入如下試劑

B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心，置于PCR儀上

C.70℃反應(yīng) 5 min ，20℃ hold（80℃熱蓋），立即進(jìn)行下步反應(yīng)

D.在上步反應(yīng)期間，配制如下Mix

E.輕彈混勻，瞬時(shí)離心

F.取 cDNA 反應(yīng)產(chǎn)物 9 μL 中加入 10 μL 上述 Mix

G.輕彈混勻，瞬時(shí)離心

H.42℃反應(yīng) 45 min ，20℃ hold（52℃熱蓋），立即進(jìn)行下步反應(yīng)

I.向反應(yīng)完的產(chǎn)物中加入 2 μL Iso-Seq template switch oligo ，總體積達(dá)到 21 μL

J.輕彈混勻，瞬時(shí)離心

K.42℃反應(yīng) 15 min ，4℃ hold（52℃熱蓋）

2)磁珠純化

A.將上步反應(yīng)產(chǎn)物（21μL），移入新的1.5mL低吸離心管中，加入29μLElutionBuffer

B.向1.5mL離心管中加入1.3×（65μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻

C.室溫孵育10min

D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s

F.棄上清，重復(fù)漂洗一次

G.瞬時(shí)離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管中加入21μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管

3)cDNA擴(kuò)增

A.取一新的1.5mL 離心管，加入如下試劑

Reagent Volume（μL）

B.向純化產(chǎn)物中加入27μl上述mix

C.加入2μlIso-SeqprimerBarcode，總體積達(dá)到50μl

D.充分輕彈混勻，瞬時(shí)離心

E.按照下面反應(yīng)程序反應(yīng)

 

4)磁珠純化

A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中

B.向50μL體積1.5mL離心管中加入0.9X（45μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時(shí)離心

C.室溫孵育10min

D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加入200μl新配置的80%乙醇，靜置30s

F.棄上清，重復(fù)漂洗一次

G.棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管

J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總

5)混樣

A.根據(jù) Qubit 檢測(cè)結(jié)果、數(shù)據(jù)需求量進(jìn)行混樣，混樣總量達(dá)到 55ng ，置于冰上

B.輕彈混勻，瞬時(shí)離心

6)kinnex PCR

A.分別加入以下試劑

B.分 22.5 μL 的 Mix 產(chǎn)物加入到 8 連排管中

C.每管中加入2.5μL Kinnex primer mix A-HQ

D.輕彈混勻，瞬時(shí)離心

E.按照下面反應(yīng)程序反應(yīng)

7)磁珠純化

A.將上步PCR產(chǎn)物分別導(dǎo)入一新的1.5mL低吸離心管中，總體積184μL

B.向1.5mL離心管中加入1.05X（193μL）體積的SMRTbell cleanup beads磁珠，充分混勻，瞬時(shí)離心

C.室溫孵育10min

D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加入200μl的新配置的80%乙醇，靜置30s

F.棄上清，重復(fù)漂洗一次

G.棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管分別加入24μL的Elution Buffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新1.5mL離心管

J.取2μL稀釋液進(jìn)行Qubit定量，確定PCR產(chǎn)物總量

8)串聯(lián)

A.分別加入以下試劑

B.配置以下mix

C.向41μL反應(yīng)產(chǎn)物中加入17μL的mix，輕彈混勻，瞬時(shí)離心

D.45℃反應(yīng)60min，4℃hold（52℃熱蓋）

E.加入2μLDNArepairmix，輕彈混勻，瞬時(shí)離心

F.45℃反應(yīng)30min，4℃hold（60℃熱蓋）

9)磁珠純化

A.將上步反應(yīng)產(chǎn)物移入新的1.5mL低吸離心管中，總體積60μL

B.向1.5mL離心管中加入1×（60μL）體積的SMRTbellcleanupbeads磁珠（室溫平衡30min），充分輕彈混勻

C.室溫孵育10min

D.瞬時(shí)離心，將樣品置于磁力架上至上清液澄清（約2min）

E.棄上清，保持離心管于磁力架上，沿對(duì)壁加200μl的新配置的80%乙醇（注意不要吹起磁珠），靜置30s

F.棄上清，重復(fù)漂洗一次

G.瞬時(shí)離心，用10μl槍頭棄盡上清，室溫干燥1min

H.向離心管中加入40μL的ElutionBuffer，輕彈混勻，室溫孵育5min

I.置于磁力架上2min，轉(zhuǎn)移上清液至新200μL離心管

J.使用Qubit檢測(cè)濃度

10)酶處理

A.向上述純化產(chǎn)物中分別加入以下試劑

B.使用寬口槍頭輕輕吹打10次，混勻上述樣品，瞬離1s

C.孵育

11)PB磁珠片段篩選

A.向上述產(chǎn)物中加入3.1*體積的 2.85*稀釋的AMPure PB磁珠（室溫平衡30分鐘）

B.使用寬口槍頭輕輕吹打15次，混勻上述樣品，瞬離1s

C.室溫放置20min，瞬離1s

D.轉(zhuǎn)移離心管到磁力架上，直至磁珠完全吸附，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，備用

E.使用1.5ml 新配的80%酒精洗滌磁珠，30秒后棄掉酒精，重復(fù)一次

F.瞬離1s，將酒精棄凈

G.向管中加入 1X Elution Buffer，使用寬口槍頭輕輕吹打15次，進(jìn)行混勻

H.室溫10-15min溶解DNA，瞬離1s

I.吸取上清液于新的1.5 mL低吸附離心管中

J.取1 μL稀釋5倍，使用Qubit進(jìn)行濃度測(cè)定。純化后DNA樣品可以在4℃保存2周，可以長期保存于-20℃，但避免反復(fù)凍融

4、測(cè)序方法

1)最終文庫通過濃度（Qubit）檢測(cè)，總量需要大于Smrtlink

2)使用REVIO SPRQ POLYMERASE KIT（Pacbio，USA） 對(duì)上機(jī)文庫進(jìn)行上機(jī)前的結(jié)合，使文庫結(jié)合上Primer（Pacbio，USA）及Polymerase（Pacbio，USA）

3)將最終的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SMRTbell cleanup beads（Pacbio，USA）純化后置于Revio（Pacbio，USA）測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序

5、實(shí)驗(yàn)試劑

6、實(shí)驗(yàn)設(shè)備