1、提取方法

1)樣本研磨

2)將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過1h

3)溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫

4)12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的2.0 ml 無菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

5)吸取上清液700 ul至新的2.0 ml 無菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min

6)吸取上清液450 ul至新的1.5 ml無菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h

7)12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時離心，用200ul槍頭吸棄多余液體

8)向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清

9)瞬時離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀

10)加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用

注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動物組織在裂解時加入2%的蛋白酶K；宏基因組項目提取在裂解時加入5%-10%的溶菌酶

2、檢測方法

2.1檢測方法

使用 使用 Qubit（廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性

2.2判定標準

濃度≥5ng/ul

總量大于等于8 0 ng

主帶清晰、主帶不清晰，主要彌散在2K以上

核酸狀態(tài)正常

3、建庫方法

3.1建庫流程圖

3.2樣本稀釋

1)核對任務單中項目樣品基本信息，根據(jù)信息單一一對應排好樣本

2)根據(jù)標準用量，計算“稀釋后濃度(ng/μL)”和“吸取體積(μL)”

3)取已滅菌的國產(chǎn)96孔PCR板，在板子上標注相應的項目編號、板號、日期及稀釋字樣，并開始稀釋

4)稀釋后，震蕩輕混（勿劇烈震蕩）并瞬時離心，對稀釋后的樣品取2 μL做Nanodrop 檢測

5)如果濃度與理論濃度偏差較大先檢查樣品是否用錯，在確認樣品使用無誤的情況下，濃度高的加水稀釋，濃度低的加DNA或者重新稀釋

3.3步驟A

根據(jù)任務單的酶切方案選擇下面所列單酶切或雙酶切方案，取適當起始量樣本，進行37℃酶切反應，在水浴鍋中反應時長不超過15h

3.4步驟B

在上述反應產(chǎn)物中加入試劑，在PCR儀器中進行3′端加A處理

3.5步驟C

向上述產(chǎn)物中加入一定體積的連接試劑及index，充分混勻，進行Dual-index測序接頭反應

3.6PCR 擴增及電泳檢測

1)加入 PCR 反應所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據(jù) PCR 反應條件，放入 PCR 儀中進行 PCR 擴增

3)對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測

3.7PCR 產(chǎn)物的純化及電泳檢測

1)將全部PCR產(chǎn)物進行磁珠純化

A.將MagicPure Size Selection DNA Beads（全式金）磁珠提前 30min 室溫平衡備用

B.將PCR產(chǎn)物轉入 1.5mL 離心管中，加入（0.8 X）體積已混勻的磁珠，吹吸混勻

C.旋轉混勻儀上，室溫混勻，瞬時離心，而后置于磁力架上，靜置，移棄上清液

D.離心管置于磁力架上，向離心管中加入新鮮配制的 80%乙醇，磁力架上靜置 30s，移棄上清液

E.重復步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用 10μL 槍頭將上清液去除干凈

F.離心管置于磁力架上，打開管蓋，室溫干燥至磁珠表面無光澤，有細微裂紋

G.取下離心管，加入無菌水，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉入新的 0.2mL PCR 管中

2)對PCR純化產(chǎn)物進行電泳檢測

3.8定量及混樣

1)將PCR純化產(chǎn)物進行Nanodrop 定量

2)根據(jù)上機數(shù)據(jù)量及定量結果，電泳結果，回收膠電泳上樣量，進行混樣量計算

3)向1.5ml離心管中按照計算好的混樣量，加入PCR純化產(chǎn)物，并混合均勻

3.9電泳切膠

1)配制2%電泳回收膠

2)使用TAE跑電泳，根據(jù)下單規(guī)定的切膠范圍進行切膠

3)對切膠片段進行過柱純化回收

3.10上機文庫構建PCR擴增

1)在上述膠回收產(chǎn)物中加入 PCR 反應所需的各種試劑，混勻，離心

2)根據(jù) PCR 反應條件，放入 PCR 儀中進行 PCR 擴增及純化

3.11上機文庫準備

將PCR純化產(chǎn)物出庫，進行后續(xù)文庫質(zhì)檢及上機測序

3.12文庫質(zhì)檢

1)質(zhì)檢方法：文庫通過 Qsep-400進行片段質(zhì)檢， 使用 Qubit 3 .0進行文庫濃度的定量

2)質(zhì)檢標準：濃度≥1ng/ul ，峰圖在要求切膠范圍之內(nèi)，片段單一無雜峰

3.13建庫試劑耗材

1)文庫構建試劑：NEB（New England Biolabs）（使用的是單個散裝試劑，不是成套試劑盒，具體試劑保密）

2)產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTM DNA Clean Beads， 貨號N411-03

3)質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 標準DNA 卡夾

4)定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki

5)1.5ml離心管、0.2ml PCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen

3.14建庫設備

4、測序方法

測序設備：NovaSeq X plus

測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit