Nanopore測(cè)序技術(shù)借助單個(gè)分子通過(guò)納米孔時(shí)引起孔兩側(cè)電位差來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)檢測(cè),納米孔的直徑僅允許單個(gè)核苷酸聚合物通過(guò),而ATCG四種堿基以及帶有甲基化修飾的堿基的帶電性質(zhì)不同,因此通過(guò)電信號(hào)差異特征即可檢測(cè)出通過(guò)納米孔的堿基類(lèi)型,從而實(shí)現(xiàn)甲基化修飾的檢測(cè)。
Nanopore三代單分子納米孔測(cè)序可以同時(shí)檢測(cè)全基因組范圍單堿基的5mC和6mA修飾位點(diǎn),并給出單堿基的甲基化水平!甲基化數(shù)據(jù)的序列信息還可以用于重測(cè)序分析,一套數(shù)據(jù)分析5mC&6mA的甲基化的同時(shí)還能進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)流程按照 Oxford Nanopore Technologies(ONT) 公司提供的標(biāo)準(zhǔn) protocol 執(zhí)行,包括樣品質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)測(cè)序等流程。
CpG島(CpG island, CGI)是富含CpG二核苷酸的一些區(qū)域,分別統(tǒng)計(jì)CpG島、上游、下游分 的平均甲基化水平
選擇甲基化水平高的6mA 位點(diǎn)周?chē)膮^(qū)域,識(shí)別6mA位點(diǎn)可能的 motif 信息,堿基信號(hào)的高度代表該堿基在該位置上的相對(duì)頻率
計(jì)算區(qū)域內(nèi)所有滿(mǎn)足深度位點(diǎn)的甲基化水平均值,繼而展示全基因組范圍內(nèi)的甲基化水平
基于全基因組甲基化水平進(jìn)行樣品間的相關(guān)性分析(此分析至少需要 2 個(gè)樣品),使用皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)計(jì)算所有樣品共有位點(diǎn)的甲基化水平之間相關(guān)性。
如果 DMR 注釋到基因的非基因間區(qū),則認(rèn)為該基因是 DMR 的關(guān)聯(lián)基因,對(duì)DMR關(guān)聯(lián)基因分別進(jìn)行 富集分析
不可以,必須直接上DNA,如果PCR后堿基上的甲基化修飾會(huì)被隱藏掉,無(wú)法通過(guò)電信號(hào)判斷出來(lái)。
N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenine,6mA)是指腺嘌呤6位氮原子的甲基化修飾。對(duì)于真核生物來(lái)講,關(guān)于DNA甲基化的研究主要集中在5mC上。然而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展發(fā)現(xiàn)6mA在真核生物中不但存在還起著非常重要的作用。關(guān)于6mA甲基化在發(fā)育、疾病中所起的作用還需要大家共同探索。
6mA-IP-seq是研究用6mA的抗體去富集發(fā)生甲基化的區(qū)域,該技術(shù)最后找到的是發(fā)生甲基化區(qū)域的Peak,而非單堿基分辨率下研究每個(gè)A堿基的甲基化狀態(tài)。而Nanopore測(cè)序根據(jù)電信號(hào)直接判斷堿基是否發(fā)生甲基化修飾,進(jìn)而根據(jù)多條read的信息去計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平。甲基化水平的變化與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān),單堿基分辨率研究位點(diǎn)的甲基化水平的變化對(duì)于研究甲基化的功能至關(guān)重要。