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醫(yī)學(xué)Nanopore全基因組重測序

產(chǎn)品介紹

重測序是對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并進一步對個體或群體進行差異性分析。

Nanopore測序借助單個分子通過納米孔時引起孔兩側(cè)電位差來實現(xiàn)信號檢測，納米孔的直徑僅允許單個核苷酸聚合物通過，而ATCG四種堿基的帶電性質(zhì)不同，因此通過電信號差異特征即可檢測出通過納米孔的堿基類型，從而實現(xiàn)測序。

技術(shù)優(yōu)勢

長讀長

理論上Nanopore技術(shù)的測序平均讀長能夠達到幾十到上百 Kb，最長讀長能達到2 Mb以上級別；由于讀長長，有以下優(yōu)勢：

1、直接跨越結(jié)構(gòu)變異斷點，利于變異（拷貝數(shù)變異CNV、插入、缺失、易位和倒位）檢測；

2、直接跨越串聯(lián)重復(fù)序列、高GC/AT序列、高度多態(tài)性區(qū)域、高度同源區(qū)域等特殊區(qū)域，檢測能力大大優(yōu)于二代測序。

低成本

相比其他三代測序技術(shù)，ONT測序樣本處理極其簡單，無需DNA聚合酶、連接酶和dNTPs，測序價格低；

無需PCR擴增

避免二代測序中PCR擴增可能引入的錯誤；

可直接讀取堿基修飾信息

如DNA甲基化5mC、6mA等，無須像二代測序需要經(jīng)過重硫酸鹽轉(zhuǎn)化或者免疫沉淀富集實驗。

實驗流程

實驗流程按照 Oxford Nanopore Technologies(ONT) 公司提供的標準 protocol 執(zhí)行，包括樣品質(zhì)量檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測和文庫測序等流程。

重測序分析流程

結(jié)果展示

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結(jié)構(gòu)變異圈圖

結(jié)構(gòu)變異圈圖

根據(jù)檢測得到的變異信息整合成 Circos 圖，對基因組數(shù)據(jù)進行可視化展示。

Repeat分析

對測序數(shù)據(jù)進行串聯(lián)重復(fù)序列分析，可以檢測重復(fù)元件的核心序列和重復(fù)次數(shù)。

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Repeat分析
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差異CNV/SV的基因注釋

差異CNV/SV的基因注釋

對識別到的差異 CNV/SV 進行基因注釋，并對這些基因進行功能注釋及富集分析，GO注釋分類統(tǒng)計圖，直觀的反映出在生物過程（biological process）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function），所有基因和差異基因注釋GO term的個數(shù)分布。

HLA分型

若樣本為人，則會有HLA分型分析，可展示樣本在不同分辨率下的等位基因的多樣性。橫坐標代表不同的 HLA 基因，縱坐標代表每個等位出現(xiàn)的頻率。如果基因中顏色的種類越多說明該基因在所研究的群體中的其多樣性越高

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HLA分型

?常見問題

片篩和非片篩文庫的區(qū)別是什么？

片篩即片段篩選，如果片篩文庫則會選擇長的DNA片段，因此需要的DNA量要多；非片篩文庫即不進行片段篩選的打斷文庫，即將DNA打斷成固定長度。

片篩文庫得到的序列相對更長，適用于基因組組裝。而非片篩文庫得到的read相對較短，適用于重測序或甲基化檢測。

重測序一般要測多少數(shù)據(jù)量？

原則上講數(shù)據(jù)量的越多，檢測到的結(jié)構(gòu)變異越多越準。由于經(jīng)費限制推薦至少測15X的數(shù)據(jù)量，如果是腫瘤等特殊組織建議測15X以上的數(shù)據(jù)量。具體原因可參考下述鏈接：

https://mp.weixin.qq.com/s/2hQfOYksbkJaONrPwYhWUw