阿爾茨海默氏?。ˋD）是一種常見、進行性和致命的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其特征是神經(jīng)元丟失和錯誤折疊蛋白質(zhì)的定型沉積，但AD中細胞功能障礙的核心基礎(chǔ)尚不清楚，AD尚未在單個細胞基因組層面進行檢查。本期我們一起來追尋對AD和神經(jīng)典型對照個體大腦的單個神經(jīng)元應(yīng)用了單細胞全基因組測序（scWGS）組學(xué)技術(shù)在遺傳疾病方面的應(yīng)用，希望能給大家對AD的研究帶來新的思路。

研究背景

阿爾茨海默氏癥的癡呆癥隨著神經(jīng)變性的進展而發(fā)展，但導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和死亡的具體事件仍然鮮為人知。在正常衰老期間，神經(jīng)元以類似于分裂細胞的速度逐漸積累軀體突變，這表明遺傳因素、環(huán)境暴露或疾病狀態(tài)可能會影響這種積累在這里，本文分析了來自阿爾茨海默病患者和神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層和海馬體的319個神經(jīng)元的單細胞全基因組測序（scWGS）數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏癥患者的體細胞DNA改變增加，分子模式不同，正常神經(jīng)元主要以與年齡相關(guān)的模式（特征A）積累突變，這與之前在健康和癌細胞中描述的“時鐘狀”突變特征非常相似。神經(jīng)變性中DNA改變的異常積累為阿爾茨海默病發(fā)展過程中發(fā)生的分子和細胞事件的級聯(lián)提供了見解。

材料方法

材料：年輕的神經(jīng)典型對照組（9人）、老年神經(jīng)典型對照組（11人）、阿爾茨海默氏病患者（9人）；一共29人，總計：319個神經(jīng)元，172個PFC-MDA神經(jīng)元，78個HC-MDA神經(jīng)元，69個PFC-PTA神經(jīng)元

方法：對319個神經(jīng)元進行單細胞全基因組測序。

研究結(jié)論

AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平。AD神經(jīng)元中基因組SNV積累的模式似乎與正常衰老的加重不同，這表現(xiàn)為（1）特征C的豐富，特征C存在于神經(jīng)典型對照個體的大腦中，但有限；（2）特征特異性轉(zhuǎn)錄影響。這些基因組變化可能包括一系列表現(xiàn)形式，包括單鏈DNA病變和雙鏈突變。AD神經(jīng)元體細胞改變的具體模式還提供了關(guān)于其原因和AD發(fā)病機制潛在影響的線索并確定潛在的治療目標，scWGS技術(shù)深度揭示AD疾病發(fā)病機制與體細胞突變的積累有關(guān)，為其治療提供了理論基礎(chǔ)。

主要研究結(jié)果

1、衰老期間神經(jīng)元的體細胞突變

對從AD和神經(jīng)典型對照個體的大腦中分離出來的神經(jīng)元進行了單細胞全基因組測序（scWGS），染色了泛神經(jīng)元標記NeuN來標記神經(jīng)元，并進一步只標記了大的NeuN陽性核，使用多位移放大（MDA）進行全基因組擴增，分析了8例AD的91個神經(jīng)元和18個神經(jīng)典型對照組的159個神經(jīng)元。在神經(jīng)典型個體中，神經(jīng)元sSNVs隨著年齡的增長而增加，sSNVs的年增長率相當(dāng)高，從每年13到55個sSNV不等，在一些特殊細胞類型中，分裂突變率更高。沒有神經(jīng)診斷的個體的海馬CA1神經(jīng)元顯示，隨著年齡的增長，sSNVs呈積累的趨勢，這與神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層（PFC）神經(jīng)元中看到的sSNV的增加沒有顯著差異。

在正常的PFC神經(jīng)元中，與年齡相關(guān)的突變增加主要由某些C>T和T>C變化驅(qū)動，從PFC和海馬錐體神經(jīng)元的復(fù)合數(shù)據(jù)集中對sSNVs進行簽名分解分析表明，簽名A在每個神經(jīng)元中的貢獻隨著年齡的增長而增加，每年獲得15.0±1.2 sSNVs。這種與年齡相關(guān)的特征A突變的增加與PFC和海馬錐體神經(jīng)元相似（P = 0.18，線性混合模型），并且是正常神經(jīng)元中與年齡相關(guān)的sSNV積累的主要驅(qū)動因素。轉(zhuǎn)錄可以通過轉(zhuǎn)錄相關(guān)損傷或無效修復(fù)使表達的位點對軀體突變敏感。

2、AD中的體細胞突變特征分析

評估了8名AD患者大腦神經(jīng)元中sSNVs的負擔(dān)，發(fā)現(xiàn)AD神經(jīng)元sSNVs明顯高于預(yù)期。AD神經(jīng)元在MDA實驗中也顯示sSNVs顯著增加。在PFC中，在八例AD個體病例中觀察到AD中sSNVs相對于正常衰老的顯著增加。AD中sSNV計數(shù)高的幾個基因組來自海馬體，其中8例中有5例與正常衰老相比，sSNVs顯著增加。AD中的神經(jīng)元包含數(shù)百種額外的sSNV，超出了其年齡的預(yù)期，這表明該疾病過程產(chǎn)生的基因組損傷水平與十多年來sSNV的正常積累相當(dāng)。變異的廣泛基因組分布表明，體細胞突變不是構(gòu)成疾病發(fā)病機制的特定初始事件，而是繼發(fā)性的，這是由引發(fā)AD和誘變過程的其他事件引起的。

AD神經(jīng)元的突變特征分析，在所有樣本中，A突變都會隨著年齡的增長而增加，這表明這種時鐘狀特征（與癌癥5的時鐘樣特征SBS5最相似）構(gòu)成了基因組老化的固有特征。簽名A還顯示，相對于年齡匹配的控制，AD略有增加，這在這些MDA實驗中沒有達到統(tǒng)計學(xué)意義，但表明這些突變機制在疾病環(huán)境中可能會被強調(diào)。另一方面，AD神經(jīng)元與對照組相比，簽名C明顯增加。鑒于AD4.31-33中報告了活性氧（ROS）和氧化核酸病變的增加，在AD中積累標志性C的合理機制是，氧化損傷的增加壓倒了NER，而NER也可能在AD中也會減弱。

由于我們的突變特征分析表明，DNA氧化——之前在AD4.11患者大腦的批量分析中觀察到——可能會導(dǎo)致AD中過量的sSNV，使用針對8-oxoG的抗體進行免疫熒光顯微鏡顯示，AD神經(jīng)元中的8-oxoG水平明顯高于神經(jīng)典型對照神經(jīng)元。表明氧化核苷酸損傷水平的增加有助于C>A變化和AD神經(jīng)元中標志性C的增加。

對神經(jīng)元功能和生存至關(guān)重要的基因突變可能會直接影響細胞適應(yīng)性，對于簽名A，轉(zhuǎn)錄期間的事件似乎在產(chǎn)生突變方面發(fā)揮作用，而簽名C與表達式成反比，因此可以在轉(zhuǎn)錄期間更有效地修復(fù)，包括通過TC-NER35修復(fù)。對AD和對照神經(jīng)元中位突變的基因本體學(xué)（GO）分析顯示，參與神經(jīng)元功能的基因被sSNVs豐富。當(dāng)與表達式-sSNV結(jié)果一起考慮時，AD神經(jīng)元顯示轉(zhuǎn)錄過程對突變生成的影響，這種轉(zhuǎn)錄影響可以在配對的DNA鏈上產(chǎn)生不對稱的突變模式。

在蛋白質(zhì)編碼基因中，AD神經(jīng)元表現(xiàn)出比年齡匹配的對照神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的非同義突變，對AD37腦脊液和腦組織中的克隆CD8+ T細胞的觀察表明，這種自激活可能與AD有關(guān)。功能失調(diào)的神經(jīng)元在AD中會明顯更豐富，這可能會因某些AD相關(guān)基因的長度而加??；因此損害神經(jīng)元功能可能是sSNVs影響細胞生理學(xué)的一種方式。

3、PTA擴增對AD神經(jīng)元基因組突變特征分析

基于PTA（初級模板定向放大）的人類神經(jīng)元scWGS證實，體細胞突變隨著年齡的增長而增加。對MDA分析的大多數(shù)大腦的神經(jīng)元小樣本（來自7例AD的29個神經(jīng)元和13個神經(jīng)典型對照組的40個神經(jīng)元）進行了基于PTA的scWGS，并確認AD神經(jīng)元與對照組相比包含更多的改變，PTA檢測到的sSNVs代表雙鏈體細胞突變。
PTA檢測到的突變，這再次證實了簽名A突變以時鐘般的方式隨著年齡的增長而增加，AD神經(jīng)元中的簽名A略有顯著增加（P = 0.04，線性混合模型）。AD神經(jīng)元總突變的增加一樣，PTA突變特征發(fā)現(xiàn)反映了MDA放大神經(jīng)元基因組的趨勢。其中包括SBS8和SBS30，它們與DNA修復(fù)酶NTHL1有關(guān)，NTHL1參與氧化性病變修復(fù)。轉(zhuǎn)錄區(qū)域PTA檢測到的sSNVs負荷與大腦中的基因表達水平相關(guān)，而簽名A和C突變顯示的模式與MDA檢測到的sSNV相似，指出轉(zhuǎn)錄活動對突變發(fā)生的特殊影響。因此，兩種scWGS方法都確定了類似的模式，并表明AD中的致病突變機制包括DNA氧化、NER DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄活性。

總結(jié)

兩種不同的單細胞全基因組測序技術(shù)揭示了AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平，未來探索更多的體細胞突變模式解釋這些氧化性病變?nèi)绾瓮ㄟ^與衰老過程中發(fā)生的突變相互作用來損害基因組功能。

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